Coprocultivo e identificación de larvas L3 de rumiantes

Para qué sirve

Los huevos no dicen el género. Los estrongílidos de los rumiantes producen huevos que no se distinguen bien entre sí. La forma más simple de saber qué géneros hay es cultivar los huevos hasta la larva infectante, la L3, e identificarla (Zajac et al., 2021). Esta página complementa la ficha de nematodos gastrointestinales de rumiantes.

Cuándo pedirlo. En la práctica, el tratamiento y el control apuntan al grupo completo y no a una especie, así que casi nunca hace falta identificar el género (Zajac et al., 2021). Es una inferencia de Evidencia Vet: el cultivo tiene sentido cuando el género cambia una decisión, como saber si predomina Haemonchus, que causa anemia, o qué género sobrevivió a un tratamiento en un test de reducción del conteo de huevos.

Otra opción. Ya hay protocolos de PCR para identificar los géneros en las heces, y algunos se ofrecen en forma comercial (Zajac et al., 2021).

Qué detecta y qué no

Detecta los géneros de estrongílidos cuyos huevos salen en las heces: Haemonchus, Teladorsagia, Ostertagia, Trichostrongylus, Cooperia, Oesophagostomum, Chabertia y Bunostomum (Zajac et al., 2021; van Wyk y Mayhew, 2013).

No sirve para:

• Saber cuántos gusanos hay de cada género. Las proporciones de géneros en el cultivo no predicen la cantidad de adultos en el tubo digestivo. Haemonchus contortus pone tantos huevos que puede dominar el cultivo de un ovino aunque haya muchos adultos de otros géneros (Zajac et al., 2021).
• Nematodirus. Sus larvas casi no aparecen en los cultivos (Zajac et al., 2021), y como su huevo se reconoce en la flotación, se suele contar aparte (van Wyk y Mayhew, 2013).
• Separar algunos géneros cercanos. Oesophagostomum y Chabertia se separan con dificultad (Zajac et al., 2021), y Trichostrongylus y Teladorsagia se confunden cuando tienen la vaina (van Wyk y Mayhew, 2013).

El cultivo

La humedad justa. Las heces deben quedar húmedas, no mojadas, porque las larvas sobreviven mal en material muy húmedo. En bovinos se mezclan bien y se humedecen si están secas; si están muy blandas, se agrega turba o vermiculita. Los pellets de ovinos y caprinos se pueden cultivar enteros (Zajac et al., 2021). van Wyk y Mayhew (2013) desmenuzan los pellets y los mezclan con vermiculita, y piden estandarizar la humedad, porque cambia el largo de las larvas.

El recipiente. Un vaso o frasco con una capa de heces de varios centímetros, con una tapa suelta que deje pasar el aire, frene a las moscas y evite que se seque (Zajac et al., 2021). van Wyk y Mayhew (2013) usan un frasco de boca ancha de cerca de 1 L, con unos 5 cm de heces apenas compactadas y un orificio central.

Tiempo y temperatura. Las dos fuentes difieren:

Fuente	Temperatura	Duración	Cuidados
Zajac et al. (2021)	Ambiente	10 a 20 días	Revolver a diario para frenar los hongos y oxigenar; agregar agua si se seca
Zajac et al. (2021)	27 °C	7 días	Igual que arriba
van Wyk y Mayhew (2013)	26 a 28 °C, en oscuridad	5 a 7 días	Revisar y volver a humedecer si hace falta

Muestras del recto. Las heces tomadas del recto evitan la contaminación con nematodos de vida libre del suelo (Zajac et al., 2021).

Cómo recoger las larvas

Con Baermann. Al terminar el cultivo, las larvas se recogen con la técnica de Baermann (Zajac et al., 2021).

Por las paredes del frasco. van Wyk y Mayhew (2013) rocían las paredes internas del frasco y lo ponen a la luz: las larvas suben por las paredes, desde donde se lavan y se recogen varias veces durante algunos días.

Larvas que no suben. Las de Bunostomum y Gaigeria trepan mal y se recuperan con el frasco lleno de agua e invertido sobre una placa Petri (van Wyk y Mayhew, 2013).

Cómo identificar la larva

Prepararla. Se pone una o dos gotas del líquido con larvas en un portaobjetos y una cantidad igual de lugol, que las mata y las tiñe para examinarlas bien (Zajac et al., 2021). van Wyk y Mayhew (2013) usan el lugol ya diluido, para que la tinción tarde unos minutos.

Qué mirar. La forma de la cabeza, la forma de la cola y la forma de la vaina que se extiende más allá de la cola. Se evalúan las dos puntas en cada larva antes de identificarla (Zajac et al., 2021). La vaina es la cutícula retenida de la L2 y protege a la larva en el ambiente (Zajac et al., 2021).

El criterio principal. Para van Wyk y Mayhew (2013), lo más útil es el largo de la extensión de la cola de la vaina, más allá del final de la cola de la larva. Lo expresan como múltiplo de “X”, el de Trichostrongylus, que mide cerca de 33 µm.

Las medidas solas no bastan. El largo total y el de la vaina se superponen entre géneros y cambian con las condiciones del cultivo y la edad de la larva, así que no se usan solos para identificar (Zajac et al., 2021).

Clave resumida (van Wyk y Mayhew, 2013; Zajac et al., 2021):

Grupo	Género	Cola de la vaina	Otros rasgos
Corta	Trichostrongylus	Cerca de 1 X	Cabeza afinada; la cola de la larva puede terminar en uno o dos tubérculos
Corta	Teladorsagia	Cerca de 1 X	Cabeza cuadrada, con un “hombro”; más grande que Trichostrongylus
Media o corta, según la fuente	Ostertagia (bovinos)	Algo más de 2 X según van Wyk y Mayhew; corta según Zajac et al.	Cabeza cuadrada
Media	Haemonchus	2,2 a 2,7 X en ovinos; 2,7 a 4 X en bovinos	Cabeza la más estrecha y redondeada; punta de la vaina a menudo con un leve quiebre
Media	Cooperia	Cerca de 2,4 X en ovinos y 3,1 X en bovinos para C. oncophora	Cabeza cuadrada, con dos cuerpos refringentes
Media	Bunostomum	Cerca de 2,4 X	Larva pequeña; vaina delgada
Larga	Chabertia	Cerca de 4 X	Cabeza ancha y redondeada; más células intestinales que Oesophagostomum
Larga	Oesophagostomum	Cerca de 5 X	Cabeza ancha y redondeada
Larga	Nematodirus	Mucho más larga	Larva grande; cola con prolongaciones
Sin vaina	Strongyloides papillosus	No tiene vaina	Esófago muy largo

Las células intestinales. Separan a Oesophagostomum de Chabertia, y las fuentes dan cifras distintas: 18 a 22 y 28 a 32 células según van Wyk y Mayhew (2013), y 16 a 24 y 24 a 32 según Zajac et al. (2021). van Wyk y Mayhew (2013) las hacen visibles congelando y descongelando las larvas sin vaina.

Calibrar con la referencia. Con un micrómetro de platina se cuenta cuántas divisiones del ocular corresponden a 33 µm en cada objetivo; en el microscopio de van Wyk y Mayhew (2013), eran unas 4 divisiones a 100 aumentos. Así, la cola de Trichostrongylus sirve de regla para las demás. El procedimiento de calibración está en la página de microscopio y control de calidad.

Cómo contar

Cuántas larvas. Por convención se identifican las primeras 100 a 200 L3 de cada cultivo (van Wyk y Mayhew, 2013).

Trichostrongylus y Teladorsagia. Con la vaina puesta se separan mal, así que se cuentan juntas (van Wyk y Mayhew, 2013).

Larvas que no son de estrongílidos. En los cultivos pueden aparecer L3 de Strongyloides, sin vaina, y nematodos de vida libre si las heces se contaminaron con tierra (Zajac et al., 2021). Los adultos de vida libre y la variedad de tamaños ayudan a reconocerlos (Zajac et al., 2021).

Cultivos de referencia. van Wyk y Mayhew (2013) recomiendan que cada laboratorio mantenga cultivos de referencia de Trichostrongylus para comparar.

En Chile

Lo que hay. Un estudio de resistencia antihelmíntica en terneros de Osorno, de 2007, identificó qué géneros sobrevivieron al tratamiento con ivermectina: Cooperia, Trichostrongylus y Nematodirus (ver la ficha de nematodos gastrointestinales de rumiantes).

Lo que falta. No se encontraron estudios publicados que muestren qué géneros predominan en cada zona del país (ver la ficha de nematodos gastrointestinales de rumiantes).

Errores frecuentes

Error	Qué produce	Fuente
Cultivar heces muy mojadas	Larvas que no sobreviven	Zajac et al. (2021)
Cerrar el frasco	Cultivo sin aire	Zajac et al. (2021)
No revolver ni humedecer	Hongos y cultivo seco	Zajac et al. (2021)
Usar heces del suelo	Nematodos de vida libre en el cultivo	Zajac et al. (2021)
Identificar solo por el largo total	Géneros confundidos	Zajac et al. (2021)
Leer las proporciones como carga de gusanos	Sobrestimar Haemonchus	Zajac et al. (2021)
Cambiar la humedad entre cultivos	Larvas de largo distinto, difíciles de comparar	van Wyk y Mayhew (2013)
Recoger solo por las paredes	Bunostomum subrepresentado	van Wyk y Mayhew (2013)

Lo que no se sabe

• Qué géneros predominan en ovinos, caprinos y bovinos de cada zona de Chile.
• Qué laboratorios chilenos ofrecen hoy coprocultivo o PCR de géneros para rumiantes.

Referencias

1. van Wyk, J. A., & Mayhew, E. (2013). Morphological identification of parasitic nematode infective larvae of small ruminants and cattle: a practical lab guide. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 80(1), 539. https://doi.org/10.4102/ojvr.v80i1.539
2. Zajac, A. M., Conboy, G. A., Little, S. E., & Reichard, M. V. (2021). Fecal examination for the diagnosis of parasitism. En Veterinary clinical parasitology (9.ª ed., pp. 1-190). Wiley-Blackwell.