Microscopio: uso, calibración y control de calidad

Para qué sirve

La lectura también es técnica. Las técnicas del manual concentran o tiñen los parásitos, pero el diagnóstico se hace al mirar. Esta página reúne lo que vale para todas: cómo usar el microscopio, cómo medir, qué objetos confunden y cómo controlar la calidad del trabajo. Complementa la guía del examen coproparasitario y el atlas de huevos, quistes y ooquistes.

Por qué medir. Medir el tamaño ayuda a identificar parásitos poco comunes o a separar organismos que se parecen y difieren sobre todo en tamaño (Zajac et al., 2021). Ejemplos del manual: los huevos de Toxocara canis y T. cati, los ooquistes de las especies de Cystoisospora y las microfilarias de Dirofilaria immitis.

Qué cubre y qué no

Cubre el microscopio compuesto de campo claro que se usa para heces, raspados, sangre y larvas.

No cubre la microscopía de fluorescencia de la auramina, que se menciona en la página de frotis directo y tinciones, ni la mantención técnica del equipo, que corresponde al servicio técnico.

Cómo usar el microscopio

El objetivo de cada cosa (Zajac et al., 2021):

Objetivo	Aumento total con ocular de 10X	Para qué
10X	100 aumentos	Recorrer la placa completa
40X	400 aumentos	Ver de cerca y buscar organismos muy pequeños, como Giardia o Cryptosporidium
100X, inmersión	1.000 aumentos	Frotis secos y teñidos, como los de sangre; no en flotaciones ni frotis húmedos

Recorrer en orden. Se empieza en una esquina y se recorre en forma sistemática toda la placa (Zajac et al., 2021).

Por qué no la inmersión en preparaciones húmedas. La solución de flotación puede tocar y dañar el lente, y la presión sobre el cubreobjetos crea corrientes que mantienen todo en movimiento (Zajac et al., 2021).

El contraste. La mayoría de los huevos y larvas tienen poco o ningún color. Se mejora el contraste bajando el condensador o cerrando su diafragma; sin condensador, se baja la intensidad de la luz. El aumento mayor necesita más luz (Zajac et al., 2021).

El foco fino. Moverlo arriba y abajo durante la lectura cambia el plano de foco: los huevos de helmintos suelen quedar a una altura un poco distinta de la de los quistes y ooquistes, y un ajuste pequeño hace aparecer lo que no se veía (Zajac et al., 2021).

Cómo calibrar el micrómetro

Las dos piezas. El micrómetro ocular es un disco con una escala que se pone dentro del ocular; sus divisiones no significan nada hasta calibrarlas. El micrómetro de platina es un portaobjetos con una escala de largo conocido, por ejemplo 1 mm dividido en 100 partes de 10 µm (Zajac et al., 2021).

Cada objetivo por separado. La calibración se hace para cada objetivo con el ocular que se va a usar, y solo vale para esa combinación de ocular y objetivo en ese microscopio. Los factores se anotan y se dejan junto al microscopio (Zajac et al., 2021).

El procedimiento (Zajac et al., 2021):

1. Poner el micrómetro de platina y enfocar hasta que las líneas se vean nítidas.
2. Hacer coincidir una línea del ocular, en general el cero, con una línea de la platina.
3. Buscar más adelante otro par de líneas que coincidan exactamente.
4. Dividir la distancia en µm de la platina por el número de divisiones del ocular entre ambos pares. El resultado es el factor de calibración en µm por división.

Un ejemplo. Es un ejemplo de Evidencia Vet: si a 40X la división 50 del ocular coincide con la división 12 de la platina, esas 50 divisiones miden 12 × 10 = 120 µm, y cada división del ocular vale 120 ÷ 50 = 2,4 µm. Un ooquiste que ocupa 15 divisiones mide 15 × 2,4 = 36 µm.

Para medir. Se superpone la escala del ocular al huevo o quiste, se cuentan las divisiones que ocupa y se multiplican por el factor del objetivo en uso (Zajac et al., 2021).

Sin calibrar. Aunque no se calibre cada objetivo, la escala del ocular sirve como referencia constante para comparar objetos (Zajac et al., 2021). Si no hay micrómetro, se compara con los glóbulos rojos del propio animal, como en la página de frotis sanguíneo y test de Knott.

Recalibrar. Si es posible, el microscopio se recalibra a intervalos regulares (Zajac et al., 2021).

El fijador cambia el tamaño. Las medidas de referencia valen para el medio en que se tomaron: las microfilarias, por ejemplo, se miden fijadas en formalina, y otros fijadores o la sangre guardada cambian su tamaño (ver la página de frotis sanguíneo y test de Knott). En las larvas L3 de rumiantes, la humedad del cultivo también cambia el largo (van Wyk y Mayhew, 2013).

Seudoparásitos y parásitos espurios

Dos cosas distintas (Zajac et al., 2021):

• Seudoparásitos: objetos ingeridos que se parecen a formas parasitarias.
• Parásitos espurios: huevos o quistes de parásitos de otro hospedador, que el animal comió al practicar coprofagia o al cazar y que solo atraviesan su tubo digestivo.

Los más comunes (Zajac et al., 2021):

Objeto	Se confunde con	Cómo distinguirlo
Polen, por ejemplo de pino	Huevos o quistes	Sin estructura interna clara; capa externa discontinua
Pelos de plantas e insectos	Larvas de nematodos	Sin tubo digestivo; un extremo parece cortado
Nematodos de vida libre en heces del suelo	Larvas parásitas	Hay adultos y tamaños muy variados
Ácaros de alimentos y sus huevos	Ácaros parásitos o huevos de helmintos	Patas sin estructuras para adherirse; huevos grandes, de más de 100 µm, a veces con patas dentro
Levadura Saccharomycopsis guttulatus	Quistes u ooquistes	Común en conejos y a veces en perros
Larvas de mosca o de insectos	Parásitos adultos	Segmentadas, con espiráculos en el extremo posterior
Burbujas de aire	Coccidios	Error típico de personal poco entrenado

La columna “Se confunde con” es en parte una inferencia de Evidencia Vet a partir de las descripciones del libro.

Parásitos espurios típicos (Zajac et al., 2021):

• Huevos de estrongílidos de rumiantes o equinos en un perro que come estiércol: parecen de anquilostoma, pero son más grandes.
• Coccidios de rumiantes en perros, que suelen separarse por tamaño y forma.
• Huevos de parásitos de roedores en un gato cazador.
• Huevos de cestodos de roedores o aves en el ternero.

Cómo salir de la duda. Conocer qué parásitos infectan normalmente a cada especie es la mejor defensa. Ante un posible seudoparásito o parásito espurio, se repite el examen con otra muestra; en perros y gatos, se mantiene al animal confinado o paseado con correa durante 2 a 3 días antes de tomarla (Zajac et al., 2021).

Control de calidad

El examen rara vez se controla. Aunque el control de calidad casi no se aplica a los exámenes de heces, la atención al equipo y al entrenamiento los hace consistentes (Zajac et al., 2021).

Lista de control:

Qué	Cada cuánto	Fuente
Limpiar oculares y objetivos con limpiador y papel de lentes	Rutina	Zajac et al. (2021)
Limpieza y revisión profesional del microscopio	Cada pocos años	Zajac et al. (2021)
Medir la densidad de las soluciones de flotación con densímetro	Al prepararlas y al menos una vez al mes si se usan por mucho tiempo	Zajac et al. (2021)
Medir con micrómetro calibrado y recalibrar	A intervalos regulares	Zajac et al. (2021)
Entrenar a quien hace los exámenes	Al incorporarse y en forma continua	Zajac et al. (2021)
Enviar duplicados de muestras positivas y negativas a un laboratorio de diagnóstico	Cada cierto tiempo	Zajac et al. (2021)
Probar cada lote de colorante con frotis de control positivos	Con cada lote	Henriksen y Pohlenz (1981)
Mantener cultivos de referencia de larvas L3	Permanente, en laboratorios que hacen coprocultivo	van Wyk y Mayhew (2013)

Por qué importa el entrenamiento. Un ayudante con instrucción mínima confunde burbujas de aire con coccidios y no ve los parásitos más pequeños (Zajac et al., 2021).

Leer pronto. Las placas se leen sin demora, y el resultado depende mucho de quien mira (ver la guía del examen coproparasitario). La flotación fecal detalla los tiempos de cada solución.

Errores frecuentes

Error	Qué produce	Fuente
Recorrer la placa al azar	Parásitos escasos no vistos	Zajac et al. (2021)
Leer con toda la luz	Huevos incoloros sin contraste	Zajac et al. (2021)
No mover el foco fino	Parásitos de otro plano no vistos	Zajac et al. (2021)
Usar inmersión en una flotación	Lente dañado y campo en movimiento	Zajac et al. (2021)
Usar el factor de un objetivo con otro	Medidas equivocadas	Zajac et al. (2021)
Informar un parásito espurio como infección	Tratamiento innecesario	Inferencia de Evidencia Vet a partir de Zajac et al. (2021)
No controlar la densidad de las soluciones	Parásitos que no flotan	Zajac et al. (2021)

Lo que no se sabe

• Cómo se controla hoy la calidad de los exámenes parasitológicos en clínicas y laboratorios veterinarios de Chile: no se encontraron programas ni estudios publicados.
• Cuánto se equivocan los exámenes hechos en clínicas chilenas comparados con un laboratorio de referencia.

Referencias

1. Henriksen, S. A., & Pohlenz, J. F. L. (1981). Staining of cryptosporidia by a modified Ziehl-Neelsen technique. Acta Veterinaria Scandinavica, 22(3), 594-596. https://doi.org/10.1186/BF03548684
2. van Wyk, J. A., & Mayhew, E. (2013). Morphological identification of parasitic nematode infective larvae of small ruminants and cattle: a practical lab guide. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 80(1), 539. https://doi.org/10.4102/ojvr.v80i1.539
3. Zajac, A. M., Conboy, G. A., Little, S. E., & Reichard, M. V. (2021). Fecal examination for the diagnosis of parasitism. En Veterinary clinical parasitology (9.ª ed., pp. 1-41). Wiley-Blackwell.